本发明公开了一种抗氧化活性肽及其制备方法，其特征在于以蓝圆鲹鱼肉蛋白为原料，采用枯草杆菌2709产生的碱性蛋白酶水解，水解液灭酶后经离心、超滤、凝胶层析和反相高效液相色谱等分离并确定其中两种天然抗氧化肽的结构，其氨基酸序列分别为His-Asp-His-Pro-Val-Cys(组氨酸-天冬氨酸-组氨酸-脯氨酸-缬氨酸-半胱氨酸)和His-Glu-Lys-Val-Cys(组氨酸-谷氨酸-赖氨酸-缬氨酸-半胱氨酸)，其清除50％DPPH·自由基所需浓度(EC
1.一种制备蓝圆鲹鱼肉蛋白抗氧化活性肽的方法，其特征在于以蓝圆鲹鱼肉蛋白为原料，采用枯草芽孢杆菌2709所产生的碱性蛋白酶水解，具体工艺为：(1)将蓝圆鲹鱼肉蛋白粉与水混合调成蛋白含量为1～5wt％的反应原料液，然后加入
0.002～0.05wt％碱性蛋白酶，在45～60℃及pH为7.5～10下水解3～6小时，最后加热至100℃灭酶得到酶解液；(2)将酶解液于4℃、8000r/min离心10～15min，得到上清液并使用分子量为5000Da的超滤膜超滤分离收集渗透液；(3)以去离子水为流动相采用Sephedexxa0G-15凝胶层析柱分离步骤2得到的渗透液，并用蛋白核酸检测仪于280nm处检测并测定各峰对应的洗脱液的抗氧化活性，收集高活性的2号吸收峰(见图1)组分并冻干得到冻干体；(4)将步骤3得到的冻干体用反相HPLC进一步分离，使用ODS柱(Hederaxa0ODS-C2，10×250mm)，采用含0.1％三氟乙酸的水和乙腈(0～25～60min内0～21～50％乙腈)为流动相线性洗脱，220nm波长下检测洗脱峰并收集测定各峰抗氧化活性，流速1.5mL·min^-1，根据检测谱图(见图2)收集活性最高的1号吸收峰对应的洗脱液；然后改用C18柱(Hypersilxa0ODS-C18，
4.6×250mm)对1号吸收峰洗脱液进行再次纯化，洗脱梯度为40min内0～20％乙腈，流速0.5mL·min^-1，根据检测谱图(见图3)分别收集较高活性的1号和2号吸收峰对应的洗脱液并冷冻干燥，即得二个抗氧化肽。
2.权利要求1所述的蓝圆鲹鱼肉蛋白抗氧化活性肽，其氨基酸序列分别为His-Asp-His-Pro-Val-Cys(组氨酸-天冬氨酸-组氨酸-脯氨酸-缬氨酸-半胱氨酸)(其质谱见图4)和His-Glu-Lys-Val-Cys(组氨酸-谷氨酸-赖氨酸-缬氨酸-半胱氨酸)(其质谱见图5)。技术领域
本发明属于功能食品领域，具体涉及海洋低值鱼类蓝圆鲹鱼肉蛋白抗氧化活性肽及其制备方法。xa0
背景技术
常被作为食品添加剂的化学合成类抗氧化剂如丁羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)等由于其本身具有毒、副作用而被限制使用。天然抗氧化剂不仅能够防止食品中油脂体系的氧化，而且可以防止人体内自由基的危害，延缓衰老及各种慢性退化性疾病如癌症、冠心病、糖尿病等。介于蛋白质与氨基酸之间的肽类，由于其特殊的结构特点，高安全性及显著的生物活性而被广泛研究。近年来，人们已从多种动植物蛋白中分离得到了大量的天然抗氧化肽，其中动物性蛋白源抗氧化肽以水产抗氧化肽居多。而海洋生物种类繁多，数量庞大，且其蛋白质在氨基酸的组成及序列方面都与陆地生物蛋白有很大的不同，对其开发利用也日趋活跃。《水产科学》2008年第7期370-373页报道了水解海洋蛋白如阿拉斯加青鳕、鲭鱼、金枪鱼等制备出高活性抗氧化肽。中国专利(ZL201010141974.3)公开了源自胶原蛋白的抗氧化肽及其用途，从胶原蛋白中分离得到了四个不同氨基酸序列的抗氧化肽，且能很好地应用于食品、化妆品、保健品等。xa0蓝圆鲹(Decapterusxa0maruadsi)，鲈形目鲹科圆鲹属的一种。又称池鱼，巴浪鱼等。分布于印度洋和太平洋，我国主产于南海、东海，是重要的经济鱼类之一。由于价格低、加工和回收手段落后，多制成咸干品或饲料鱼粉使用，经济效益低。近年来不少研究对其综合利用进行了探讨，如《食品研究与开发》2007年第12期、《食品工业科技》2008年第1期和《广东海洋大学学报》2009年第4期均采用不同蛋白酶酶解蓝圆鲹蛋白，分别以酶解产物中氮回收率、氨基氮的含量或多肽提取率为指标选择最适蛋白酶为实验用酶，并进行了酶解工艺条件考察。《食品科学》2009年第1期研究了温度、pH值、食品中辅料及各种金属离子对经Alcalasexa02.4酶解的蓝圆鲹抗氧化肽稳定性的影响。《中国酿造》2009年第9期与《食品研究与开发》2010年第2期分别选择中性蛋白酶和碱性蛋白酶酶解蓝圆鲹蛋白，并利用中心组合试验方法优化酶解实验条件。《中国食品学报》2012年第8期描述了响应曲面分析法优化xa0木瓜蛋白酶和风味蛋白酶水解蓝圆鲹蛋白的水解工艺条件，并采用自由基清除率对水解产物的抗氧化活性进行研究。这些都只是涉及到酶解加工技术或产物抗氧化活性及其稳定性测定等方面，从蓝圆鲹鱼肉蛋白中分离纯化出单一抗氧化活性肽的制备方法尚未见报道。xa0
发明内容
本发明提供源自海洋鱼类蓝圆鲹鱼肉蛋白抗氧化活性肽及其制备方法，其特征在于以蓝圆鲹鱼肉蛋白为原料，采用枯草杆菌2709产生的碱性蛋白酶水解，经离心、超滤、凝胶层析、反相高效液相色谱多步分离并确定其中两种天然抗氧化肽的结构。xa0本发明具体实现步骤及条件如下：xa0(1)将蓝圆鲹鱼肉蛋白粉与水混合调成蛋白含量为1～5wt％的反应原料液；然后加入0.002～0.05wt％碱性蛋白酶，在45～60℃及pH为7.5～10下水解3～6小时，最后加热到100℃以终止酶解反应；xa0(2)将步骤1)得到的酶解液于4℃、8000r/min离心10～15min，得到上清液并使用分子量为5000Da的超滤膜超滤分离收集渗透液；xa0(3)以去离子水为流动相采用Sephedexxa0G-15凝胶层析柱分离步骤2)得到的超滤渗透液，并用蛋白核酸检测仪于280nm处检测并测定各峰对应的洗脱液的抗氧化活性，收集高活性的2号吸收峰(见图1)组分并冻干；xa0(4)将步骤3)得到的冻干组分用反相HPLC进一步分离，使用ODS柱(Hederaxa0ODS-C2，10×250mm)，采用含0.1％三氟乙酸的水和乙腈(0～25～60min内0～21～50％乙腈)为流动相线性洗脱，220nm波长下检测洗脱峰并收集测定各峰抗氧化活性，流速1.5mL·min^-1，根据检测谱图(见图2)收集活性最高的1号吸收峰对应的洗脱液；然后改用C18柱(HypersilODS-C18，4.6×250mm)对1号吸收峰洗脱液进行再次纯化，洗脱梯度为40min内0～20％乙腈，流速0.5mL·min^-1，根据检测谱图(见图3)分别收集较高活性的1号和2号吸收峰对应的洗脱液并冷冻干燥，即得抗氧化肽；使用串联飞行时间质谱仪测定获得氨基酸序列分别为His-Asp-His-Pro-Val-Cys(组氨酸-天冬氨酸-组氨酸-脯氨酸-缬氨酸-半胱氨酸)(见图4)和His-Glu-Lys-Val-Cys(组氨酸-谷氨酸-赖氨酸-缬氨酸-半胱氨酸)(见图5)的两个抗氧化肽。xa0分别采用超氧阴离子自由基及DPPH·自由基清除法测定2个抗氧化肽的抗氧化能力。抗氧化肽His-Asp-His-Pro-Val-Cys清除50％DPPH·自由基所需浓度(EC₅₀)为0.0310±0.0011μM，与天然抗氧化肽谷胱甘肽的清除能力相当；清除50％超氧阴离子自由基所需浓度(EC₅₀)为0.3814±0.0017μM。抗氧化肽His-Glu-Lys-Val-Cys清除50％DPPH·自由基所需浓度(EC₅₀)xa0为0.0677±0.0012μM，清除50％超氧阴离子自由基所需浓度(EC₅₀)为0.3744±0.0021μM。由结果可知，本发明的2个源自蓝圆鲹鱼肉的抗氧化肽在这两种检测体系中均具有良好的抗氧化活性。xa0本发明制备抗氧化肽的原料来源廉价，资源丰富，制备方法简单、成本低且容易操作，具有较强的适用性；所制备的抗氧化肽的抗氧化活性强、水溶性好及安全、无毒、无副作用等，适宜应用于食品、化妆品、医药等领域。xa0分别采用DPPH·法和超氧阴离子自由基法测定本发明中蓝圆鲹鱼肉蛋白抗氧化肽的自由基清除能力，这些方法都是常规的检测方法，具体步骤如下：xa01、测定抗氧化肽清除1，1-二苯基三硝基苯肼(DPPH·)自由基能力xa0取待测样品500μL，加入500μLxa00.1mMxa0DPPH·的甲醇溶液。混匀后30℃下避光静置30min，于515nm处测定吸光度值。根据以下公式计算DPPH·自由基清除能力，其中，以去离子水替代样品，所测的吸光度值作为对照，以甲醇替代DPPH·溶液，所测的吸光度值作为空白。xa0DPPH·自由基清除能力(％)＝(对照样+空白样-待测样)×100％/对照样xa02、测定抗氧化肽清除超氧阴离子(O₂^-·)自由基能力xa0取待测样品200μL，加入5.7mLxa0tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.2)，和100μLxa05mM邻苯三酚溶液，混匀后于320nm处每隔30s测一次A_320nm，反应4min结束，得样品V_样(即每min光吸收的平均变化率)。空白管中以10mmol/Lxa0HCl代替邻苯三酚溶液，4min内邻苯三酚自氧化速率为V_白。xa0O₂^-·自由基清除能力(％)＝[(V_白-V_样)/V_白]×100％xa0
附图说明
图1是凝胶层析分离超滤渗透液时洗脱液的蛋白质检测谱图xa0图2是图1洗脱液中2号吸收峰的HPLC检测谱图xa0图3是图2洗脱液中1号吸收峰的HPLC检测谱图xa0图4是图3洗脱液中1号吸收峰的氨基酸序列质谱图xa0图5是图3洗脱液中2号吸收峰的氨基酸序列质谱图xa0具体实施方式：实施例1xa0取蓝圆鲹鱼肉蛋白粉与水混合调成蛋白含量为1wt％的反应原料液；然后加入0.03wt％碱性蛋白酶，在50℃及pH为8.0下水解3小时，最后加热到100℃以终止酶解反应。将得到的混合液于4℃，8000r/min离心10～15min，取酶解上清液并使用分子量为5000Da的超滤膜超滤分离收集渗透液，以去离子水为流动相采用Sephedexxa0G-15凝胶层析分离超滤渗透液，并用蛋白核酸检测仪于280nm处检测并测定各峰对应的洗脱液的抗氧化活性，收集高活性的2号吸收峰(见图1)用反相HPLC进一步分离，使用ODS柱(Hederaxa0ODS-C2，10×250mm)，采用含0.1％三氟乙酸的水和乙腈(55min内5～60％乙腈)为流动相线性洗脱，220nm波长下检测洗脱峰并收集测定各峰抗氧化活性，流速1.5mL·min^-1，根据检测谱图(见图2)收集活性最高的1xa0号吸收峰对应的洗脱液；然后改用C18柱(Hypersilxa0ODS-C18，4.6×250mm)对1号吸收峰洗脱液进行再次纯化，洗脱梯度为30min内0～20％乙腈，流速0.5mL·min^-1，根据检测谱图(见图3)分别收集较高活性的1号和2号吸收峰对应的洗脱液并冷冻干燥，即得抗氧化肽；使用串联飞行时间质谱测定获得氨基酸序列分别为His-Asp-His-Pro-Val-Cys(组氨酸-天冬氨酸-组氨酸-脯氨酸-缬氨酸-半胱氨酸)和His-Glu-Lys-Val-Cys(组氨酸-谷氨酸-赖氨酸-缬氨酸-半胱氨酸)的两个抗氧化肽。xa0实施例2xa0取蓝圆鲹鱼肉蛋白粉与水混合调成蛋白含量为3wt％的反应原料液；然后加入0.005wt％碱性蛋白酶，在55℃及pH为10下水解6小时，最后加热到100℃以终止酶解反应。将得到的混合液于4℃，8000r/min离心10～15min，取酶解上清液并使用分子量为5000Da的超滤膜超滤分离收集渗透液，以去离子水为流动相采用Sephedexxa0G-15凝胶层析分离超滤渗透液，并用蛋白核酸检测仪于280nm处检测并测定各峰对应的洗脱液的抗氧化活性，收集高活性的2号吸收峰(见图1)用反相HPLC进一步分离，使用ODS柱(Hederaxa0ODS-C2，10×250mm)，采用含0.1％三氟乙酸的水和乙腈(60min内0～60％乙腈)为流动相线性洗脱，220nm波长下检测洗脱峰并收集测定各峰抗氧化活性，流速1.5mL·min^-1，根据检测谱图(见图2)收集活性最高的1号吸收峰对应的洗脱液；然后改用C18柱(Hypersilxa0ODS-C18，4.6×250mm)对1号吸收峰洗脱液进行再次纯化，洗脱梯度为40min内5～20％乙腈，流速0.5mL·min^-1，根据检测谱图(见图3)分别收集较高活性的1号和2号吸收峰对应的洗脱液并冷冻干燥，即得抗氧化肽；使用串联飞行时间质谱测定获得氨基酸序列分别为His-Asp-His-Pro-Val-Cys(组氨酸-天冬氨酸-组氨酸-脯氨酸-缬氨酸-半胱氨酸)和His-Glu-Lys-Val-Cys(组氨酸-谷氨酸-赖氨酸-缬氨酸-半胱氨酸)的两个抗氧化肽。xa0实施例3xa0取蓝圆鲹鱼肉蛋白粉与水混合调成蛋白含量为5wt％的反应原料液；然后加入0.05wt％碱性蛋白酶，在45℃及pH为8.0下水解4.5小时，最后加热到100℃以终止酶解反应。将得到的混合液于4℃，8000r/min离心10～15min，取酶解上清液并使用分子量为5000Da的超滤膜超滤分离收集渗透液，以去离子水为流动相采用Sephedexxa0G-15凝胶层析分离超滤渗透液，并用蛋白核酸检测仪于280nm处检测并测定各峰对应的洗脱液的抗氧化活性，收集高活性的2号吸收峰(见图1)用反相HPLC进一步分离，使用ODS柱(Hederaxa0ODS-C2，10×250mm)，采用含0.1％三氟乙酸的水和乙腈(60min内5～55％乙腈)为流动相线性洗脱，220nm波长下检测洗xa0脱峰并收集测定各峰抗氧化活性，流速1.5mL·min^-1，根据检测谱图(见图2)收集活性最高的1号吸收峰对应的洗脱液；然后改用C18柱(Hypersilxa0ODS-C18，4.6×250mm)对1号吸收峰洗脱液进行再次纯化，洗脱梯度为50min内5～20％乙腈，流速0.5mL·min^-1，根据检测谱图(见图3)分别收集较高活性的1号和2号吸收峰对应的洗脱液并冷冻干燥，即得抗氧化肽；使用串联飞行时间质谱测定获得氨基酸序列分别为His-Asp-His-Pro-Val-Cys(组氨酸-天冬氨酸-组氨酸-脯氨酸-缬氨酸-半胱氨酸)和His-Glu-Lys-Val-Cys(组氨酸-谷氨酸-赖氨酸-缬氨酸-半胱氨酸)的两个抗氧化肽。xa0